質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)對(duì)于精確的 m/z 測(cè)量至關(guān)重要。校準(zhǔn)的定義是“將已知精度的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)或儀器與另一標(biāo)準(zhǔn)或儀器進(jìn)行比較，通過(guò)調(diào)整消除偏差”。本文中的校準(zhǔn)一詞用于表示質(zhì)量軸校準(zhǔn)。其他校準(zhǔn)（如電源電壓）不在本章討論范圍之內(nèi)。質(zhì)量軸校準(zhǔn)需要在整個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)均勻分布一系列離子。校準(zhǔn)完成后，可以在校準(zhǔn)范圍內(nèi)的任何質(zhì)量范圍獲取數(shù)據(jù)。因此，在較大的質(zhì)量范圍內(nèi)進(jìn)行校準(zhǔn)是明智之舉。手動(dòng)、半自動(dòng)和自動(dòng)校準(zhǔn)要求在程序運(yùn)行時(shí)以穩(wěn)定的速率將校準(zhǔn)液（校準(zhǔn)溶液）引入質(zhì)譜儀。校準(zhǔn)溶液通過(guò)注射泵或連接到 LC 泵的注射器直接（注入）到質(zhì)譜儀中。

建議至少每三個(gè)月校準(zhǔn)一次質(zhì)譜儀，并且大約每周檢查一次校準(zhǔn)情況。校準(zhǔn)的頻率取決于所需的質(zhì)量精度。例如，在對(duì)肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行精確質(zhì)量測(cè)量時(shí)，應(yīng)每天校準(zhǔn)儀器。不過(guò)，小分子定量分析所需的校準(zhǔn)頻率較低。

校準(zhǔn)參數(shù)

質(zhì)量分析儀應(yīng)定期注入校準(zhǔn)溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。一般使用電噴霧離子源 (ESI)。該溶液產(chǎn)生的離子（已知精確質(zhì)量）應(yīng)涵蓋整個(gè)儀器的質(zhì)量范圍，或至少涵蓋將用于后續(xù)分析的質(zhì)量范圍。

其中校準(zhǔn)所涉及的參數(shù)稱為校準(zhǔn)參數(shù)。是指：其值不隨實(shí)驗(yàn)類型而變化的儀器參數(shù)，例如峰寬、峰形、質(zhì)量分布以及分辨率與靈敏度等。

峰寬取決于質(zhì)量分辨率。在大多數(shù)小分子定性/定量應(yīng)用中，1 個(gè)質(zhì)量單位（即1 Da)的分辨率足以區(qū)分離子。單位分辨率的典型定義是:半峰高處的峰寬約為 0.6 至 0.8 質(zhì)量單位。典型臺(tái)式 LC-MS 的離子輪廓掃描帶寬約為 1 個(gè)質(zhì)量單位。

峰形和輪廓掃描。如圖 2 所示，在典型的臺(tái)式 LC-MS 中，豐度測(cè)量是以 0.10 m/z 的增量進(jìn)行采集。當(dāng)這些數(shù)據(jù)顯示在質(zhì)譜中時(shí)，可顯示一條單線。高度和位置由輪廓掃描得出。

質(zhì)量分配。使用特定的質(zhì)譜校準(zhǔn)物進(jìn)行。校準(zhǔn)物應(yīng)是特性良好的參考物質(zhì)。這些物質(zhì)的認(rèn)證和處理應(yīng)記錄在案。LC-MS 定性分析始終使用參比物質(zhì)，而定量分析則結(jié)合使用參比物質(zhì)和實(shí)際分析物標(biāo)準(zhǔn)品作為校準(zhǔn)物。

分辨率與靈敏度。質(zhì)量分辨率是離子強(qiáng)度和峰寬之間的折衷。一般來(lái)說(shuō)，分辨率越高，離子強(qiáng)度越低。

校準(zhǔn)方法

對(duì)于市場(chǎng)上最新的 LC-MS 來(lái)說(shuō)，軟件包中包含了一個(gè)自動(dòng)程序，用于在 ESI 模式下進(jìn)行調(diào)整和校準(zhǔn)。不過(guò)，較舊的儀器和/或非常特殊的應(yīng)用仍需要手動(dòng)或半自動(dòng)程序來(lái)優(yōu)化影響離子檢測(cè)的參數(shù)。在 LC-MS 儀器中，質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)分為三個(gè)步驟：

離子源和傳輸優(yōu)化

質(zhì)譜校準(zhǔn)

微調(diào)（最大限度地檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)特定離子）。

離子源和傳輸優(yōu)化。在這一步驟中，以 5 μL/min 左右的穩(wěn)定速率注入校準(zhǔn)溶液，持續(xù)數(shù)分鐘，從而在 ESI 模式下對(duì)質(zhì)譜儀的一個(gè)或多個(gè)特定離子進(jìn)行大致調(diào)整。引入校準(zhǔn)溶液化合物的最佳方法是使用大容量萊茵進(jìn)樣環(huán)（50 或 100 μL）或注射泵（如漢密爾頓注射泵）：使用大容量注射回路時(shí)，溶劑輸送系統(tǒng)應(yīng)設(shè)置為以5μL/min 左右的速度將 50 : 50 的乙腈/水或 50 : 50 的甲醇/水通過(guò)注射器注入離子源。注射 50 μL 校準(zhǔn)溶液將持續(xù)至少 10 分鐘。使用輸液泵時(shí)，應(yīng)將校準(zhǔn)溶液注入注射泵，然后用熔融石英管或 peek 管連接至 ESI 噴針。

選擇用于優(yōu)化的離子應(yīng)位于校準(zhǔn)范圍的中間或特定的相關(guān)區(qū)域（例如，咖啡因的 m/z = 195 或 PPG 校準(zhǔn)溶液的 m/z = 906.7）。在使用自動(dòng)調(diào)整程序來(lái)證明進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子傳輸達(dá)到最佳狀態(tài)之前，應(yīng)手動(dòng)調(diào)整 ESI 源噴霧器，以建立進(jìn)入質(zhì)譜儀的穩(wěn)定離子噴霧，并確保檢測(cè)到足夠的離子來(lái)校準(zhǔn)質(zhì)譜儀。

調(diào)整程度因型號(hào)而異，并取決于源的幾何形狀。一般來(lái)說(shuō)，噴霧偏離入口軸線的離子源（如正交噴霧和 Z 向噴霧）需要的調(diào)整較少。對(duì)于同軸噴霧源，為避免污染儀器光學(xué)元件，必須檢查噴霧源是否直接噴射到儀器孔口。軸上離子源通常有一個(gè)側(cè)窗，可以很好地觀察噴射軌跡。在這兩種情況下，噴霧器都應(yīng)始終小幅度移動(dòng)，直到達(dá)到所關(guān)注離子的最高信噪比的最佳位置。離子源參數(shù)（如霧化器氣體、透鏡電壓）可自動(dòng)、半自動(dòng)或手動(dòng)優(yōu)化。

質(zhì)譜校準(zhǔn)。第二步，使用校準(zhǔn)溶液校準(zhǔn) ESI 模式下的質(zhì)譜儀。所有質(zhì)量分析儀都必須校準(zhǔn)。例如，三重四極桿質(zhì)譜儀 (QQQ) 的 Q1 和 Q3 都要進(jìn)行校準(zhǔn)。以下是校準(zhǔn)過(guò)程：

01

獲取校準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖（校準(zhǔn)文件），并與存儲(chǔ)在參考文件中的校準(zhǔn)溶液質(zhì)譜峰預(yù)期質(zhì)量表進(jìn)行比對(duì)。

02

將參照文件中的每個(gè)質(zhì)譜峰與校準(zhǔn)文件中的相應(yīng)質(zhì)譜峰進(jìn)行匹配。

03

校準(zhǔn)文件中相應(yīng)的匹配質(zhì)譜峰即為校準(zhǔn)點(diǎn)。

04

通過(guò)校準(zhǔn)點(diǎn)擬合校準(zhǔn)曲線。

05

計(jì)算每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)與曲線的垂直距離。該距離代表校準(zhǔn)后的殘差。同時(shí)計(jì)算殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差。這個(gè)數(shù)字是校準(zhǔn)精度的最佳單一指標(biāo)。

06

同時(shí)計(jì)算殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差。這個(gè)數(shù)字是校準(zhǔn)精度的最佳單一指標(biāo)。

自動(dòng)校準(zhǔn)

在開始自動(dòng)校準(zhǔn)之前，需要設(shè)置一些峰值匹配參數(shù)。這些參數(shù)決定了獲取的數(shù)據(jù)必須在哪個(gè)范圍內(nèi)，軟件才能識(shí)別校準(zhǔn)質(zhì)量并成功校準(zhǔn)。這些參數(shù)包括：

01

質(zhì)譜峰搜索范圍。這是校準(zhǔn)軟件用于搜索最強(qiáng)質(zhì)譜峰的窗口。增大該窗口會(huì)增加質(zhì)譜峰匹配錯(cuò)誤的幾率。必須確保在質(zhì)譜峰搜索范圍內(nèi)找到正確的質(zhì)譜峰；否則，校準(zhǔn)可能會(huì)出現(xiàn)偏差。如果定位到不正確的峰，則應(yīng)調(diào)整搜索質(zhì)譜峰范圍，以便只定位到正確的離子。

02

質(zhì)譜峰閾值。校準(zhǔn)程序中將不使用所獲質(zhì)譜中低于強(qiáng)度閾值（通常以質(zhì)譜中最強(qiáng)峰的百分比來(lái)衡量）的所有峰。

03

質(zhì)譜峰最大標(biāo)準(zhǔn)偏差或預(yù)測(cè)質(zhì)量與實(shí)際質(zhì)量之間的最大差值。在校準(zhǔn)過(guò)程中，每對(duì)匹配峰都會(huì)測(cè)量獲取的校準(zhǔn)文件中的測(cè)量質(zhì)量與參考文件中的真實(shí)質(zhì)量之間的差值。如果該值超過(guò)設(shè)定值，校準(zhǔn)將失敗。降低標(biāo)準(zhǔn)偏差值可獲得更嚴(yán)格的限制，而增加標(biāo)準(zhǔn)偏差則意味著更容易滿足要求，但這可能會(huì)導(dǎo)致質(zhì)譜峰匹配不正確。

04

峰寬。這是一個(gè)用于設(shè)置分辨率的指標(biāo)，通常規(guī)定為最大強(qiáng)度的 50%。

如果獲取的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖相似，且所有預(yù)期質(zhì)譜峰都通過(guò)了上述標(biāo)準(zhǔn)，則校準(zhǔn)可以接受。如果儀器以前從未校準(zhǔn)過(guò)或以前的校準(zhǔn)文件丟失，則必須使用更詳細(xì)的校準(zhǔn)程序。該校準(zhǔn)程序要求從最低質(zhì)量離子開始定位已知質(zhì)譜峰。找到質(zhì)譜峰后，將為離子的精確質(zhì)量分配一個(gè)數(shù)模轉(zhuǎn)換值。

一旦對(duì)儀器進(jìn)行了全面校準(zhǔn)，下次使用儀器時(shí)并不一定需要重復(fù)全面校準(zhǔn)過(guò)程�？梢酝ㄟ^(guò)注入校準(zhǔn)溶液并將所有質(zhì)譜峰匹配參數(shù)設(shè)置為全面校準(zhǔn)時(shí)使用的值來(lái)執(zhí)行校準(zhǔn)驗(yàn)證，而不是全面校準(zhǔn)。如果預(yù)測(cè)質(zhì)量和實(shí)際質(zhì)量之間的差異不大，則原始質(zhì)量校準(zhǔn)曲線仍然有效。無(wú)論儀器型號(hào)/品牌如何，在自動(dòng)校準(zhǔn)結(jié)束時(shí)都可以獲得一份最終報(bào)告，其中顯示校準(zhǔn)溶液的預(yù)測(cè)精確質(zhì)量、質(zhì)譜中每個(gè)峰的實(shí)際質(zhì)量、這兩個(gè)質(zhì)量之間的差值（校準(zhǔn)精度），在許多情況下還會(huì)顯示實(shí)驗(yàn)中指定的所有離子的強(qiáng)度和峰寬。

微調(diào)。第三步，對(duì)一個(gè)或多個(gè)特定離子的檢測(cè)進(jìn)行優(yōu)化，以便在 ESI 或 APCI 模式下，利用相關(guān)分析物的標(biāo)準(zhǔn)（如果有的話）對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行調(diào)諧�？梢赃x擇相關(guān)分析物的質(zhì)量電荷比，或者在沒有分析物標(biāo)準(zhǔn)的情況下，選擇校準(zhǔn)溶液中最接近相關(guān)離子質(zhì)量電荷比的離子。