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數(shù)字PCR（dPCR，Digital Polymerase Chain Reaction）是一種能夠對核酸分子進行絕對定量的PCR技術。它不依賴于標準曲線或參照物，而是通過一種“分而治之”的策略來實現(xiàn)高精度的檢測。
以下是其詳細的工作原理，分為三個核心步驟：
1. 樣品分區(qū)
這是數(shù)字PCR最核心的環(huán)節(jié)。
目的：將一個標準的PCR反應體系（包含待檢測的DNA模板、引物、熒光探針等）隨機分配到成千上萬個獨立、微小的反應單元中。
方式：
（1）微滴式：通過微流控或油包水技術，將樣品生成數(shù)萬個甚至數(shù)百萬個納升級別的微滴（如Bio-Rad的QX系列）。
（2）芯片式：將樣品分配到物理分隔的微孔芯片中（如Thermo Fisher的QuantStudio系列）。
（3）物理分割：使用高密度的微流控芯片進行物理隔離。
（4）關鍵結果：分區(qū)后，每個微反應單元要么含有0個目標分子，要么含有1個（或極少數(shù)情況多個）目標分子。這個過程遵循泊松分布的統(tǒng)計學原理。
2. PCR擴增與終點檢測
分區(qū)完成后，這些反應單元（微滴或微孔）會在常規(guī)的熱循環(huán)儀上進行PCR擴增。
擴增：每個微反應單元獨立進行PCR反應。如果某個單元內包含至少一個目標DNA分子，擴增后該單元的熒光信號會顯著增強（陽性）；如果單元內沒有目標分子，則沒有熒光信號（陰性）。
檢測：擴增結束后，儀器會逐個讀取每個反應單元的熒光信號。這個過程就像數(shù)數(shù)一樣，記錄下哪些孔/微滴亮了（陽性，1），哪些沒亮（陰性，0）。
3. 絕對定量分析
這是將熒光信號轉化為精確數(shù)據(jù)的步驟。
計數(shù)：儀器統(tǒng)計陽性單元的數(shù)量（即發(fā)生了擴增的單元）和陰性單元的數(shù)量（未發(fā)生擴增的單元）。
泊松校正：理論上，我們希望在分區(qū)時每個單元最多只有一個分子。但由于隨機分布，有可能出現(xiàn)兩個或多個目標分子進入同一個單元的情況。例如，如果10000個單元中有400個是陽性，你不能簡單地認為只有400個分子，因為那400個陽性單元中可能有些單元含有多個分子。因此，需要利用泊松分布公式進行校正：通過陽性單元的比例（即陽性單元數(shù)/總有效單元數(shù)），計算出樣本中目標DNA分子的絕對起始拷貝數(shù)或濃度。
結果輸出：直接輸出拷貝數(shù)/µL（微升）或copies/reaction（拷貝/反應），無需依賴標準曲線。
與傳統(tǒng)qPCR（實時熒光定量PCR）的對比：
以下是其詳細的工作原理，分為三個核心步驟：
1. 樣品分區(qū)
這是數(shù)字PCR最核心的環(huán)節(jié)。
目的：將一個標準的PCR反應體系（包含待檢測的DNA模板、引物、熒光探針等）隨機分配到成千上萬個獨立、微小的反應單元中。
方式：
（1）微滴式：通過微流控或油包水技術，將樣品生成數(shù)萬個甚至數(shù)百萬個納升級別的微滴（如Bio-Rad的QX系列）。
（2）芯片式：將樣品分配到物理分隔的微孔芯片中（如Thermo Fisher的QuantStudio系列）。
（3）物理分割：使用高密度的微流控芯片進行物理隔離。
（4）關鍵結果：分區(qū)后，每個微反應單元要么含有0個目標分子，要么含有1個（或極少數(shù)情況多個）目標分子。這個過程遵循泊松分布的統(tǒng)計學原理。
2. PCR擴增與終點檢測
分區(qū)完成后，這些反應單元（微滴或微孔）會在常規(guī)的熱循環(huán)儀上進行PCR擴增。
擴增：每個微反應單元獨立進行PCR反應。如果某個單元內包含至少一個目標DNA分子，擴增后該單元的熒光信號會顯著增強（陽性）；如果單元內沒有目標分子，則沒有熒光信號（陰性）。
檢測：擴增結束后，儀器會逐個讀取每個反應單元的熒光信號。這個過程就像數(shù)數(shù)一樣，記錄下哪些孔/微滴亮了（陽性，1），哪些沒亮（陰性，0）。
3. 絕對定量分析
這是將熒光信號轉化為精確數(shù)據(jù)的步驟。
計數(shù)：儀器統(tǒng)計陽性單元的數(shù)量（即發(fā)生了擴增的單元）和陰性單元的數(shù)量（未發(fā)生擴增的單元）。
泊松校正：理論上，我們希望在分區(qū)時每個單元最多只有一個分子。但由于隨機分布，有可能出現(xiàn)兩個或多個目標分子進入同一個單元的情況。例如，如果10000個單元中有400個是陽性，你不能簡單地認為只有400個分子，因為那400個陽性單元中可能有些單元含有多個分子。因此，需要利用泊松分布公式進行校正：通過陽性單元的比例（即陽性單元數(shù)/總有效單元數(shù)），計算出樣本中目標DNA分子的絕對起始拷貝數(shù)或濃度。
結果輸出：直接輸出拷貝數(shù)/µL（微升）或copies/reaction（拷貝/反應），無需依賴標準曲線。
與傳統(tǒng)qPCR（實時熒光定量PCR）的對比：
| 特性 | 數(shù)字PCR （dPCR） | 實時熒光定量PCR （qPCR） |
| 原理 | 無限稀釋 + 終點計數(shù) | 擴增曲線 + Ct值（循環(huán)閾值） |
| 定量方式 | 絕對定量（直接計數(shù)） | 相對定量（依賴標準曲線） |
| 依賴標準品 | 不需要 | 必須依賴標準品或內參基因 |
| 靈敏度 | 極高（可檢測稀有突變，1/100000） | 較高 |
| 主要優(yōu)勢 | 不受擴增效率影響，高精度，抗抑制能力強 | 動態(tài)范圍寬，成本較低，操作簡便 |
